培養(yǎng)環(huán)境條件對獼猴桃花粉萌發(fā)的影響 獼猴桃花粉萌發(fā)對授粉受精起著關(guān)鍵作用
齊秀娟，張紹鈴，方金豹
（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，果樹生長發(fā)育與品質(zhì)控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450009）
（獼猴桃花粉采摘多少錢一斤）
摘要：采用離體培養(yǎng)法，在篩選出最佳培養(yǎng)基后，研究獼猴桃花粉在不同培養(yǎng)時(shí)間、pH值、溫度條件下花粉萌發(fā)和花粉管生長狀況。結(jié)果表明：獼猴桃花粉離體萌發(fā)及花粉管生長的最適培養(yǎng)基為10％蔗糖＋100mg/L硼酸＋10mg/L Ca(NO3)2；離體培養(yǎng)最適觀察時(shí)間為5.0h，最適培養(yǎng)溫度為30℃，最佳培養(yǎng)pH值為6.0。
關(guān)鍵詞：獼猴桃；培養(yǎng)條件；花粉萌發(fā)率；花粉管伸長
Effect of Environment on Pollen Germination of Kiwi
Qi Xiu-juan1，2，ZHANG Shao-ling1,FANG Jin-bao2
(1Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095；2Key Laboratory for Fruit Tree Growth, Development and Quality Control, Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009)
Abstract：
The paper reports factors influencing pollen germination and tube growth of kiwi in vitro．With this one, the effects of different time, pH values, different storage temperatures and many amines were tested. The results showed that the most suitable culture medium for pollen germination and tube growth was 10％ sugar+100mg/L boric acid+10mg/L Ca(NO3)2.The suitable watching time was after 5 hours, the best temperature for pollen germination and growth was 30℃ and the suitable pH value of culture medium was 6.0.
Key words：Kiwifruit；Effect of Environment； Pollen germination；Pollen tube growth
獼猴桃是雌雄異株的重要果樹樹種，生產(chǎn)中需要嚴(yán)格配置授粉樹，但有時(shí)因花期不遇、惡劣天氣或授粉昆蟲數(shù)量的不足，導(dǎo)致授粉受精不良，而授粉受精是其豐產(chǎn)的基礎(chǔ)，所以僅依靠天然授粉獼猴桃很難獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，故采用人工輔助授粉顯得尤為必要?；ǚ勖劝l(fā)對授粉受精起著關(guān)鍵作用【1】，花粉萌發(fā)的好壞，除與花粉本身的質(zhì)量有關(guān)外，與花粉萌發(fā)的環(huán)境條件和貯藏條件有密切關(guān)系[2]。關(guān)于獼猴桃人工輔助授粉的采粉時(shí)期、花粉貯藏條件以及Ca(NO3)2、Na6Mo7O24、MnSO4、NaCl、蔗糖、硼酸等因子對獼猴桃花粉的影響前人已做過一些研究[3，4，5]，但花粉離體萌發(fā)最佳環(huán)境條件的研究則尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以美味獼猴桃花粉為研究材料，探討其花粉的最佳離體培養(yǎng)環(huán)境條件，其結(jié)果可為獼猴桃生產(chǎn)上人工輔助授粉提供理論依據(jù)。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
1.材料和方法
1.1材料：
材料于2009年5月初選用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所獼猴桃資源圃內(nèi)同
期開花的自選美味獼猴桃雄株品系‘鄭雄1號’和‘鄭雄2號’。采集位于樹冠外圍中部的大蕾期中心雄花, 用羊皮紙袋包好，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用鑷子摘下花藥，在硫酸紙上均勻攤晾干燥，任其花藥自然開裂散粉。待花藥充分裂開后收集花粉，裝入干燥的小瓶中并密封，將小瓶放入盛有干燥劑的密閉容器中，放置到-20℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>
1.2花粉培養(yǎng)法：
采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法，即在設(shè)定培養(yǎng)基中按體積比加入0.8％瓊脂，在微波爐中溶化好后，趁熱用玻璃棒滴一滴培養(yǎng)基于凹形載玻片上，待培養(yǎng)基表面凝固以后，用頭發(fā)絲條播花粉，置于事先準(zhǔn)備好的鋪上濕濾紙的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。在40×10倍顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)，并用分析測量圖象軟件Imagepro-Plus進(jìn)行花粉管長度測量?；ǚ勖劝l(fā)以花粉管生長長度超過花粉粒直徑作為已萌發(fā)依據(jù)， 每處理統(tǒng)計(jì)4個(gè)視野，每個(gè)視野花粉不少于20粒，重復(fù)4 次。在觀察花粉萌發(fā)過程中，對花粉各個(gè)時(shí)期形態(tài)進(jìn)行拍照。借助EXCEL輔助計(jì)算進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性分析。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
1.3試驗(yàn)處理
1.3.1最適培養(yǎng)基篩選：選擇‘鄭雄1號’品種進(jìn)行最佳培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)。最適培養(yǎng)基參照姚春潮[6]等的培養(yǎng)基組成，以蔗糖、硼酸、Ca(NO3)2為培養(yǎng)基組分，設(shè)計(jì)3因子4水平的正交實(shí)驗(yàn)方案(表1)設(shè)定各成分含量，pH值6.5，培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)5h，根據(jù)所觀測的萌發(fā)率和花粉管長度，確定最佳培養(yǎng)基組分。
1.3.2最適培養(yǎng)溫度篩選：采用‘鄭雄1號’花粉進(jìn)行該試驗(yàn)。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳培養(yǎng)基(第6種培養(yǎng)基, 其組分見表1)為基本培養(yǎng)基，調(diào)pH值6.5，設(shè)置培養(yǎng)溫度(18、22、26、30、32、34、38℃)進(jìn)行培養(yǎng)，5h后取出測其萌發(fā)率及花粉管長度。
1.3.3最適培養(yǎng)時(shí)間測定：采用‘鄭雄1號’和‘鄭雄2號’兩個(gè)品種進(jìn)行該試驗(yàn)。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳培養(yǎng)基(第6種培養(yǎng)基，其組分見表1)為基本培養(yǎng)基，設(shè)定培養(yǎng)溫度26℃，調(diào)pH值6.5，設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間(0.5、2.0、5.0、12、48h)進(jìn)行培養(yǎng)，取出測其萌發(fā)率及花粉管長度。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
1.3.4最適培養(yǎng)pH值測定：采用‘鄭雄1號’花粉進(jìn)行該試驗(yàn)。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳培養(yǎng)基(第6種培養(yǎng)基, 其組分見表1)為基本培養(yǎng)基，設(shè)定培養(yǎng)溫度26℃，設(shè)置培養(yǎng)pH值（4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0）進(jìn)行培養(yǎng)，5 h后取出測其萌發(fā)率及花粉管長度。
2.結(jié)果與分析
2.1不同培養(yǎng)基對獼猴桃花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響
研究表明，獼猴桃花粉在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)率和花粉管生長長度表現(xiàn)不同（表1）。在13、14、15、16四種培養(yǎng)基上幾乎不萌發(fā)，在第5、6、7、9、10、培養(yǎng)基上均能較好的萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)到50％以上，其中在第6種培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，達(dá)到了78.2％，與其它幾種處理差異顯著；從花粉管生長長度來看，也是在第6種培養(yǎng)基上生長最長，達(dá)到159.8um，與其它幾種處理差異顯著。因此認(rèn)為，第6種培養(yǎng)基最適宜于獼猴桃花粉的萌發(fā)和花粉管生長研究，其組分為: 10%糖＋100mg/L硼酸＋10mg/LCa(NO3) 2·4H2O。
2.2溫度對花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響
由圖1可見，在18℃時(shí)，獼猴桃花粉并不萌發(fā)，說明該溫度低于獼猴桃花粉萌發(fā)的極限低溫。隨著培養(yǎng)溫度的升高花粉的萌發(fā)率也升高，培養(yǎng)溫度為3O℃時(shí)花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值為85.8％，萌發(fā)率與26℃相比差異不顯著，與其它5個(gè)處理差異顯著；當(dāng)溫度超過3O℃以后，其萌發(fā)率迅速下降，32℃花粉的萌發(fā)率僅為22.7％；在34℃時(shí)萌發(fā)率基本為0，在38℃時(shí)萌發(fā)率為0，說明該溫度超過了花粉萌發(fā)的極限高溫。
由圖2可見，培養(yǎng)溫度為3O℃時(shí)花粉管長度均達(dá)到最大值為198.6um，與其它幾種處理表現(xiàn)差異顯著；溫度32℃時(shí)花粉管長度為53.6um，僅為30℃時(shí)的27％；在34℃時(shí)只有零星花粉管生長，平均長度為26.6um，且在此溫度下，花粉管大都比較粗短，且易破裂，未萌發(fā)即破裂的花粉較多，通過測量34℃和38℃條件下的花粉直徑，后者平均比前者增大了3.41um，說明溫度過高不僅抑制了花粉的萌發(fā)，阻礙花粉管的伸長，還會使花粉管、花粉本身顯著膨脹。
試驗(yàn)表明，26～30℃范圍內(nèi)是花粉萌發(fā)和花粉管生長較適宜溫度，30℃是花粉培養(yǎng)最適溫度。培養(yǎng)溫度過高或過低都會抑制獼猴桃花粉的萌發(fā)和花粉管生長。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
2.3培養(yǎng)時(shí)間對花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響
圖3、圖4分別代表不同培養(yǎng)時(shí)間處理對‘鄭雄1號’和‘鄭雄2號’兩個(gè)品種花粉萌發(fā)率和花粉管生長的影響。
由圖3可見，在培養(yǎng)0.5～5h時(shí)間范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，花粉萌發(fā)率表現(xiàn)增加，培養(yǎng)5h時(shí)，花粉萌發(fā)率分別為76.4％和55.3％，與培養(yǎng)0.5h和2.0h達(dá)到了顯著差異；‘鄭雄1號’在培養(yǎng)0.5h和2.0小時(shí)范圍內(nèi)，增加幅度不大，差異未達(dá)顯著水平，‘鄭雄2號’雖然達(dá)到了顯著差異，但增加只有14％；在培養(yǎng)2～5h范圍內(nèi)花粉萌發(fā)率急劇上升，‘鄭雄1號’與0.5h時(shí)相比增加了66.1％，‘鄭雄2號’與0.5h時(shí)相比增加了44.1％；在培養(yǎng)5～12h范圍內(nèi)‘鄭雄1號’萌芽率上升緩慢，二者數(shù)據(jù)未達(dá)顯著差異水平，‘鄭雄2號’上升較多，達(dá)到了顯著差異水平。在12～48h內(nèi)‘鄭雄1號’變化較大，數(shù)據(jù)達(dá)到顯著差異，‘鄭雄2號’變化較小，數(shù)據(jù)未達(dá)到顯著差異水平。
由圖4可見，培養(yǎng)不同時(shí)間對獼猴桃花粉管生長長度表現(xiàn)明顯不同。在培養(yǎng)0.5～5h時(shí)間范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，花粉管長度總體表現(xiàn)增加趨勢；培養(yǎng)0.5h和2.0小時(shí)范圍內(nèi)，增加幅度不大，均未達(dá)到顯著差異水平，兩個(gè)品種表現(xiàn)相似的趨勢；在培養(yǎng)2～5h范圍內(nèi)花粉管長度顯著增加，在培養(yǎng)5h時(shí)，‘鄭雄1號’花粉管長度平均為155um，‘鄭雄2號’花粉管長度平均為108.2um，分別為培養(yǎng)0.5h時(shí)的3倍和3.66倍；在培養(yǎng)5～48h范圍內(nèi)‘鄭雄1號’花粉管長度表現(xiàn)略有下降趨勢，48h時(shí)的花粉管長度顯著低于5h時(shí)的花粉管長度；‘鄭雄2號’在5～12小時(shí)內(nèi)花粉管長度表現(xiàn)上升，在12～48h內(nèi)，花粉管長度表現(xiàn)平緩。
基于兩個(gè)品種培養(yǎng)5h之后萌芽率和花粉管長度表現(xiàn)趨勢并不完全一致，所以認(rèn)為離體培養(yǎng)時(shí)間5h較為適宜。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
2.4培養(yǎng)基pH 值對花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響
圖5、圖6表示培養(yǎng)基的pH 值對花粉萌發(fā)和花粉管生長有明顯的影響。由圖5可見，在pH4～5 的范圍內(nèi)花粉萌發(fā)率沒有明顯變化，pH4時(shí)萌發(fā)率為52.8％，pH5時(shí)萌發(fā)率為53.2％；在pH5～6范圍內(nèi)萌發(fā)率表現(xiàn)明顯上升，且在pH6.0時(shí)達(dá)到最大值，萌發(fā)率為81.5％，與其它幾種處理達(dá)到了顯著差異；以后隨著pH上升，萌發(fā)率表現(xiàn)下降，pH＝7時(shí)萌發(fā)率為34.6％，在pH﹥7后萌發(fā)率幾乎為0。
從圖6可見，在pH4～5 的范圍內(nèi)花粉管長度沒有明顯變化，pH4時(shí)花粉管長度為130.9um，pH5時(shí)花粉管長度為129.8um；在pH5～6范圍內(nèi)花粉管長度表現(xiàn)明顯上升，且在pH6.0時(shí)達(dá)到最大值，花粉管長度為261.2um，與其它幾種處理達(dá)到了顯著差異；以后隨著pH上升，花粉管長度表現(xiàn)下降，在pH＝8.0時(shí)只有零星花粉管生長，在pH＝9.0時(shí)無一花粉管生長。
本研究表明，獼猴桃花粉萌發(fā)和花粉管生長的最適pH 值是6.0，即獼猴桃花粉適合于在微酸性培養(yǎng)基上萌發(fā)和生長。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
3.討論
花粉萌發(fā)和花粉管的伸長速率對受精至關(guān)重要。如果速率過低，花粉管在到達(dá)子房之前胚珠就會退化，導(dǎo)致不能受精，從而影響坐果。花粉離體萌發(fā)試驗(yàn)的結(jié)果在某種程度上可以代表花粉粒在果園內(nèi)的實(shí)際受精能力，二者具有一定的聯(lián)系。
花粉萌發(fā)及花粉管生長是一個(gè)極其復(fù)雜的生理代謝過程，在離體培養(yǎng)時(shí)不僅受培養(yǎng)基組分的影響，也與培養(yǎng)的環(huán)境因素有很大關(guān)聯(lián)。獼猴桃新鮮花粉生活力較高【7】，但在柱頭上能否萌發(fā)還受到各種環(huán)境因子的影響。溫度是影響花粉活力變異的最主要來源，在花粉生長的過程中，花粉粒內(nèi)化學(xué)物質(zhì)對外界溫度的反應(yīng)敏感【8】。各種植物只有在自己最適溫度范圍內(nèi)，萌發(fā)率才會高，低于或高于這個(gè)溫度就會使萌發(fā)受到影響。也就是說，在溫度較低時(shí)花粉活力低，隨著溫度的升高活力增強(qiáng)，但是溫度升到一定值后再升高將對花粉的活力有抑制作用[9]，這與生物體內(nèi)酶的特性相似，最適溫度主要取決于植物的生理特點(diǎn)和其內(nèi)反應(yīng)酶的特性。研究表明，獼猴桃花粉萌發(fā)受溫度的調(diào)控非常明顯，離體培養(yǎng)的最適宜溫度范圍為26～30℃，最適宜溫度為30℃。鄭州獼猴桃資源圃雄株開花期通常在5月初，據(jù)2009年田間溫度記錄儀調(diào)查5月1日～5月15日果園小氣候溫度在14～35℃左右，在正常氣候條件下不會影響雄株花粉的散布與傳播，但是如遇陰雨天、花期低溫或異常高溫，很難正常散布花粉，導(dǎo)致授粉受精不良，坐果率偏低或果實(shí)發(fā)育畸形。所以授粉受精不良是鄭州地區(qū)獼猴桃果實(shí)表現(xiàn)畸形的重要原因之一。如人工雜交授粉，也應(yīng)選擇溫度適宜且晴朗無風(fēng)的天氣進(jìn)行。黃家興[10]等研究表明凱特杏花粉的萌發(fā)和花粉管生長的最適溫度范圍是15～25℃；吳開志等[11]研究表明核桃花粉的最適宜培養(yǎng)溫度為25℃；杜玉虎等[12]研究表明果梅花粉的培養(yǎng)適宜溫度為25℃；Kakani等[13]研究表明棉花花粉萌發(fā)和花粉管生長適宜溫度為32℃。從以上不同的研究結(jié)果可以看出，不同的植物間花粉萌發(fā)和花粉管生長的最適宜溫度存在一定差異。
▲獼猴桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)
培養(yǎng)基中適宜的pH值是保證花粉萌發(fā)和花粉管生長的重要條件，過高或過低的pH 值都會抑制花粉萌發(fā)和花粉管生長。張紹鈴等[14]研究表明梨花粉萌發(fā)和花粉管生長所需的最適pH值為6.5；趙艷玲等[15]研究表明蘿卜花粉離體培養(yǎng)的最適宜pH為7.0；黃家興等[10]研究表明凱特杏花粉萌發(fā)和花粉管生長最適pH 值為6.0。本研究中獼猴桃花粉培養(yǎng)適宜pH值為6.0，這與黃家興等[9]的研究結(jié)果相近，但不同的植物間花粉的萌發(fā)率及花粉管生長所需的pH值還是存在一定差異。
(獼猴桃花粉)
(獼猴桃花粉)
(獼猴桃花粉授粉)
(獼猴桃授粉)
(獼猴桃蜜蜂授粉)
(獼猴桃花粉)
(獼猴桃花粉)
獼猴桃花粉
獼猴桃花粉授粉
獼猴桃花粉檢測
（獼猴桃花粉價(jià)格多少錢）
貴州獼猴桃花粉
紅心獼猴桃花粉授粉
有機(jī)獼猴桃價(jià)格
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