摘 要：以獼猴桃‘徐香’（較不耐貯藏）和‘海沃德’（耐貯藏）果實(shí)為試材，研究其在 0 ℃貯藏期間生理及組織結(jié)構(gòu)的變化差異，從而探究其與耐貯性的關(guān)系。結(jié)果表明：貯藏期間兩品種果肉硬度均不斷下將，‘海沃德’果肉硬度降至 10 N 的時(shí)間為 150 d，而‘徐香’僅為 95 d；‘徐香’的呼吸高峰和乙烯釋放高峰的出現(xiàn)分別較‘海沃德’早 20 d 和 10 d，且峰值分別高出 16%和 250%。貯藏期間‘徐香’果實(shí)的質(zhì)量減少率也顯著高于‘海沃德’。在整個(gè)貯藏期間，‘海沃德’果實(shí)的淀粉、原果膠、纖維素含量均高于‘徐香’，而淀粉酶（AM）、果膠代謝相關(guān)酶（多聚半乳糖醛酸酶 PG、果膠甲酯酶 PE、β–半乳糖苷酶 β-Gal）和纖維素酶（Cx）的活性高峰值均低于‘徐香’。‘海沃德’的表皮毛極顯著細(xì)短于‘徐香’；且角質(zhì)層厚度及表皮細(xì)胞層數(shù)都大于‘徐香’；貯藏期間果肉細(xì)胞的形變程度‘海沃德’小于‘徐香’；‘海沃德’的細(xì)胞壁厚于‘徐香’，且貯藏期間中膠層分裂緩慢，線粒體較完整?？傊唾A性好的獼猴桃品種角質(zhì)層和表皮細(xì)胞厚，質(zhì)量減少率較低，呼吸速率和乙烯釋放速率慢，細(xì)胞壁酶活性低。
關(guān)鍵詞：獼猴桃；耐貯性；果膠酶；超微結(jié)構(gòu)；組織結(jié)構(gòu)
▲獼猴桃花粉打包好即將發(fā)運(yùn)
獼猴桃是典型的呼吸躍變型果實(shí)，其后熟過程會出現(xiàn)明顯的呼吸躍變，生理代謝旺盛，淀粉快速降解，糖分增加，進(jìn)而果肉變軟、衰老、腐爛，不利于貯藏（黃文俊和鐘彩虹，2017）。不同獼猴桃品種間果實(shí)耐貯性差異很大，培育品質(zhì)優(yōu)異且耐貯藏的品種是現(xiàn)代育種的主要目標(biāo)（張培正 等，1992；李東 等，2015）。
獼猴桃‘海沃德’果實(shí)雖然糖酸比較低（Asiche et al .，2016），口味偏酸，但因其耐貯性好，在 0 ℃冷藏可高達(dá) 6 個(gè)月之久（Arpaia et al.，1987；Ritenour et al.，1999），而成為國際市場的主栽品種?！煜恪侵袊鴥?yōu)良的獼猴桃品種之一，可溶性固形物含量較高，香味濃郁，酸甜可口，深受國人的喜愛（趙英杰 等，2013），但其貯藏時(shí)間相對較短，且耐冷性較差（張浩，2014）?！煜恪汀Ｎ值隆瑢偻硎斓拿牢断但J猴桃，且采收期基本一致，但兩者的耐貯性差異很大（王西銳，2014）。
本試驗(yàn)中選用耐貯性差異較大的獼猴桃‘海沃德’和‘徐香’為試驗(yàn)材料，從果實(shí)采后生理及組織結(jié)構(gòu)變化方面比較兩者的內(nèi)部差異，為選育品質(zhì)優(yōu)良耐貯藏的獼猴桃新品種提供參考。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料及其處理
供試獼猴桃‘徐香’和‘海沃德’均采自陜西省武功鎮(zhèn)綠益隆公司同一獼猴桃基地，樹齡、樹形、樹勢及栽培管理一致且無膨大劑噴施。兩品種在可溶性固形物達(dá)到一致時(shí)采收（采收時(shí)‘徐香’為 7%，‘海沃德’為 7.1%）。采收當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，散去田間熱。選擇果形端正、大小均勻、果皮顏色均勻一致、無病蟲害及機(jī)械損傷的果實(shí)，貯藏于（0 ± 0.5）℃，RH 90% ~ 95%的冷庫中。
每個(gè)品種隨機(jī)挑選果實(shí) 450 個(gè)，設(shè)置 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。入庫當(dāng)天測定初始值，之后每 10 d 取樣1 次進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，并留樣液氮速凍保存于–80 ℃超低溫冰箱用于后續(xù)其他指標(biāo)的測定。直至果實(shí)硬度降至 10 N 停止取樣，統(tǒng)計(jì)貯藏天數(shù)。并于入貯當(dāng)天、呼吸躍變前后、貯藏末期 4 個(gè)時(shí)期取樣，每個(gè)時(shí)期取 5 個(gè)果實(shí)，用于組織結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察。入貯時(shí)，兩品種每重復(fù)隨機(jī)取樣 15個(gè)果實(shí)，用于呼吸速率和乙烯釋放速率的測定，每個(gè)指標(biāo)重復(fù) 3 次，同時(shí)兩品種隨機(jī)選取 50 個(gè)果實(shí)，用于統(tǒng)計(jì)失重率。
▲獼猴桃結(jié)果像葡萄一樣多了
1.2 果實(shí)生理指標(biāo)測定和果實(shí)結(jié)構(gòu)觀察
果肉硬度用 GY-4 型硬度計(jì)（杭州綠博公司）測定；果實(shí)質(zhì)量減少率參照 Khaliq 等（2015）的方法測定；呼吸速率和乙烯釋放速率的測定參照董曉慶等（2009）的方法，分別使用 Tel-7001 型CO2 分析儀（美國 Telaire 公司）和 Trace GC Ultra 型氣相色譜儀（美國 Thermo Scientific 公司）；淀粉酶活性的測定參照 Bonghi 等（1996）的方法，淀粉含量的測定參照曹建康等（2007）的方法；果膠含量的測定采用咔唑比色法，纖維素含量的測定采取蒽酮法，果膠酶及纖維素酶活性測定采用分光光度法（曹建康 等，2007）。
石蠟切片的制作參照 Ban 等（2016）的方法，于光學(xué)顯微鏡（Olympus，U-TV0.63XC）下觀察、成像，用 ImageJ 軟件測量。
掃描電鏡的觀察參照 Konarska（2013）的方法，在 S-3400N 型掃描電子顯微鏡（加速電壓 5 ~ 15 kV）下觀察并數(shù)碼拍照，用 ImageJ 軟件測量。
透射電鏡的觀察參照 He 等（2018）的方法，于 JEM-1230 型透射電子顯微鏡（JEOL，Tokyo，Japan）下觀察并數(shù)碼拍照，用 ImageJ 軟件測量。
采用 Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。用 Sigma Plot 12.5 軟件作圖，采用 ANOVA 單因素方差分析的 Duncan's Range Multiple 進(jìn)行檢驗(yàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 ‘徐香’和‘海沃德’獼猴桃果實(shí)貯藏期間相關(guān)生理指標(biāo)的比較
2.1.1 硬度和質(zhì)量減少率
果實(shí)硬度是反映果實(shí)耐貯性和衡量果實(shí)貯藏效果的重要指標(biāo)。如圖 1 所示，‘徐香’和‘海沃德’采收當(dāng)天的硬度分別為 118.8 和 144.9 N，兩者存在極顯著差異。兩個(gè)品種的果實(shí)硬度在整個(gè)貯藏期間均呈先快速下降后緩慢下降的變化趨勢，且‘海沃德’的硬度始終顯著高于‘徐香’。當(dāng)兩者果實(shí)硬度下降至同一硬度（10 N）時(shí)，‘海沃德’貯藏期達(dá) 150 d，比‘徐香’（95 d）貯藏期長 55 d。質(zhì)量減少率是影響果實(shí)耐貯性的另一重要指標(biāo)。隨著貯藏時(shí)間的延長，兩品種質(zhì)量減少率均呈上升趨勢，在貯藏中后期，‘海沃德’極顯著低于‘徐香’。
2.1.2 呼吸速率和乙烯釋放速率
如圖 2 所示，兩個(gè)品種果實(shí)貯藏期間的呼吸速率和乙烯釋放速率均出現(xiàn)高峰?！煜恪粑叻宄霈F(xiàn)在貯藏 10 d 時(shí)，峰值達(dá) 8.43 mg · kg-1 · h-1，‘海沃德’呼吸高峰出現(xiàn)在貯藏 30 d 時(shí)，峰值達(dá)7.27 mg · kg-1 · h-1，與‘徐香’相比，推遲了呼吸高峰出現(xiàn)的時(shí)間且峰值也較低?！煜恪蚁┽尫鸥叻宄霈F(xiàn)在 35 d 時(shí)，比‘海沃德’提前 5 d，且峰值是‘海沃德’的 3.5 倍。
2.1.3 淀粉含量和淀粉酶活性
如圖 3 所示，采收當(dāng)天，‘海沃德’淀粉含量極顯著高于‘徐香’，在整個(gè)貯藏期間，淀粉含量均呈下降趨勢，且‘海沃德’一直高于‘徐香’。此外，兩個(gè)品種的淀粉酶活性呈先上升后下降的趨勢，兩者都在貯藏 40 d 時(shí)達(dá)到酶活性高峰，‘徐香’的峰值為 5.83 mg · g-1 · min-1，極顯著高于‘海沃德’（4.79 mg · g-1 · min-1）。
▲獼猴桃包裝盒
2.1.4 纖維素含量和纖維素酶活性
纖維素是構(gòu)成果肉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)，與果實(shí)硬度密切相關(guān)。如圖 4 所示，在整個(gè)貯藏期，兩品種的纖維素含量均呈下降趨勢，且‘海沃德’始終極顯著高于‘徐香’。兩品種纖維素酶活性隨著貯藏時(shí)間的延長均呈先升后降的趨勢，且都在 45 d 時(shí)出現(xiàn)高峰，‘徐香’和‘海沃德’峰值分別為 3.09 和 2.53 mg · h-1 · g-1，前 45 d‘徐香’極顯著高于‘海沃德’。
2.1.5 果膠物質(zhì)
果膠是細(xì)胞壁初生壁和中膠層的重要組成成分，果膠物質(zhì)含量及成分的變化是影響果實(shí)硬度的關(guān)鍵因素之一。如圖 5 所示，在整個(gè)貯藏期間，‘海沃德’原果膠（Acid-soluble pectin，ASP）含量均高于‘徐香’，且在貯藏前 40 d 差異極顯著。兩品種水溶性果膠（Water-soluble pectin，WSP）均呈逐漸上升趨勢，且在整個(gè)貯藏期間‘徐香’極顯著高于‘海沃德’。
▲獼猴桃開花授粉
2.1.6 細(xì)胞壁酶活性
果實(shí)軟化過程中細(xì)胞壁降解與 PG、PE、β-Gal 等酶活性密切相關(guān)。如圖 6 所示，‘徐香’和‘海沃德’兩品種果實(shí)的 PG 酶活性均呈先上升后下降趨勢?！煜恪?45 d 達(dá)到高峰（2.6 mg · h-1 · g-1），‘海沃德’在 65 d 達(dá)到高峰（1.4 mg · h-1 · g-1），相比‘徐香’推遲 20 d 且峰值較低。兩品種的 PE酶活性也呈先升后降的趨勢，在采收時(shí)二者均處于較低水平，差異不明顯。但在整個(gè)貯藏期間，‘徐香’始終極顯著高于‘海沃德’，前者在 30 d 達(dá)到高峰，后者在 40 d 達(dá)到高峰，同時(shí)前者峰值（1.83 μmol · min-1 · g-1）是后者（0.78 μmol · min-1 · g-1）的 2.3 倍。兩品種的 β-Gal 酶活性呈波動(dòng)上升趨勢，且‘徐香’始終極顯著高于‘海沃德’。
▲獼猴桃苗
2.2 ‘徐香’和‘獼猴桃’果實(shí)貯藏期間組織結(jié)構(gòu)變化比較
2.2.1 表皮毛結(jié)構(gòu)
通過掃描電鏡觀察和測量（表 1）得知，‘徐香’的表皮毛較‘海沃德’長而粗。‘徐香’的表皮毛長度為 2.42 mm，‘海沃德’為 1.67 mm；‘徐香’表皮毛直徑為 52.16 μm，‘海沃德’為 25.35 μm。
如圖 7 所示，‘徐香’和‘海沃德’采收時(shí)兩品種表皮毛覆蓋度高且‘徐香’表皮毛更明顯。到在貯藏末期（90 d），‘徐香’已皺縮，失水嚴(yán)重，而‘海沃德’仍較為飽滿。
2.2.2 細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)
兩品種果實(shí)果皮均有一層質(zhì)地均勻且連續(xù)的角質(zhì)膜覆蓋在表皮細(xì)胞的最外層上，且內(nèi)側(cè)滲透到表皮細(xì)胞間隙中形成角質(zhì)層。采收當(dāng)天觀察‘海沃德’的角質(zhì)層比‘徐香’厚，表皮細(xì)胞層數(shù)（8層）約為‘徐香’（3 層）的 2.7 倍（表 1），細(xì)胞較粗短且排列緊密，呈規(guī)則的長圓形，而‘徐香’的表皮細(xì)胞較狹長且排列較為疏松（圖 8，0 d）。
貯藏 30 d 時(shí)，‘徐香’表皮細(xì)胞體積變大，排列疏松，果肉細(xì)胞體積也增大，而‘海沃德’表皮細(xì)胞仍為長卵圓形、排列緊密，同時(shí)果肉細(xì)胞也排列緊密（圖 8，30 d）；貯藏至 60 d，‘徐香’果肉細(xì)胞失去飽滿度、排列不規(guī)則；至 80 d 時(shí)，‘徐香’表皮細(xì)胞體積增大至近圓形，果肉細(xì)胞大量破裂，細(xì)胞壁染色程度低，形成許多小空腔，而‘海沃德’細(xì)胞變化較小，表皮細(xì)胞和果肉細(xì)胞排列仍緊密，果肉細(xì)胞僅有極少數(shù)破裂（圖 8，60 d、80 d）。
2.2.3 細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)
對這兩個(gè)品種的果實(shí)薄壁組織進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察：采收當(dāng)天，果肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與其內(nèi)含物緊貼細(xì)胞壁，細(xì)胞壁整齊，結(jié)構(gòu)致密，呈明—暗—明分區(qū)結(jié)構(gòu)；中膠層為一薄的高電子密度暗層，均勻且連續(xù)；內(nèi)含有大量結(jié)構(gòu)完整、質(zhì)膜清晰的細(xì)胞器（圖 9，0 d）；‘海沃德’細(xì)胞壁 1.39 μm，極顯著厚于‘徐香’的 0.68 μm（表 1）。貯藏 40 d 時(shí)，‘徐香’中膠層已裂解，細(xì)胞之間相互分離，形成大的細(xì)胞間隙，而‘海沃德’胞間層仍可見，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)仍較完整（圖 9，40 d）。貯藏末期（80 d），‘徐香’細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)已嚴(yán)重變形，質(zhì)壁分離，形成絮狀空隙，微纖絲散落，而‘海沃德’胞間層稍有溶解，微纖絲較為松散，結(jié)構(gòu)較為完整（圖 9，80 d）。
▲zespri yellow kiwi
2.2.4 線粒體超微結(jié)構(gòu)
對兩品種果實(shí)薄壁組織進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在采收當(dāng)天，兩品種線粒體結(jié)構(gòu)完整，呈球狀或桿狀，基質(zhì)充滿整個(gè)線粒體（圖 10，0 d）；貯藏 40 d 時(shí)，‘徐香’線粒體出現(xiàn)腫脹變大，內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊不清，有一部分線粒體已空泡化，而此時(shí)‘海沃德’線粒體結(jié)構(gòu)雖稍有膨大，內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊，但無空泡化的線粒體出現(xiàn)（圖 10，40 d）；至貯藏末期（80 d），‘徐香’線粒體幾乎全部空泡化，破裂崩解，而‘海沃德’線粒體結(jié)構(gòu)只有少數(shù)出現(xiàn)空泡化，結(jié)構(gòu)相比‘徐香’較為完整（圖10，80 d）。
▲紅心獼猴桃果園
3 討論
3.1 果實(shí)結(jié)構(gòu)與耐貯性的關(guān)系
果實(shí)耐貯性與果實(shí)自身的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，果皮角質(zhì)層和表皮細(xì)胞的厚度都會影響果實(shí)水分的散失，導(dǎo)致果實(shí)質(zhì)量減少，硬度下降（Maguire et al.，1999；Veraverbeke et al.，2003）。角質(zhì)層具有耐酸堿、耐氧化和不易透水、透氣的特性（李宏建 等，2013）。果實(shí)貯藏期間，角質(zhì)層有延緩氣體交流，抑制呼吸，減少水分散失的作用（林建城，2007）。本研究中，耐貯藏的獼猴桃‘海沃德’角質(zhì)層較厚，且深入到表皮細(xì)胞之間，表皮細(xì)胞層數(shù)較多，果肉細(xì)胞短小，形狀規(guī)則，排列緊密；而較不耐貯藏的‘徐香’果肉細(xì)胞狹長，大小不均勻，排列較為松散，且隨著貯藏時(shí)間的延長，果肉細(xì)胞變化幅度比較大。此外，‘徐香’表皮毛比‘海沃德’的粗且長，貯藏末期前者果實(shí)表面已皺縮，而后者相對飽滿，這可能也與表皮毛的表面積有關(guān)，表皮毛表面積越大，果實(shí)表面的蒸騰面積越大，果實(shí)失水越嚴(yán)重，進(jìn)而引起果實(shí)生理代謝紊亂，呼吸作用加強(qiáng)，相關(guān)物質(zhì)降解加快，導(dǎo)致果實(shí)硬度下降，耐貯性變差。
▲海沃特獼猴桃
3.2 呼吸速率和乙烯釋放速率與果實(shí)耐貯性的關(guān)系
呼吸作用和乙烯釋放是果實(shí)采收后新陳代謝的主導(dǎo)因素，在果實(shí)后熟與軟化過程中起主要的調(diào)控作用（吳彬彬 等，2008；Gwanpua et al.，2014；Ireland et al.，2014）。劉超超等（2011）報(bào)道，3 個(gè)蘋果品種的呼吸和乙烯釋放高峰后出現(xiàn)細(xì)胞壁降解酶活性高峰，引起果實(shí)軟化。本研究中耐貯的獼猴桃‘海沃德’的呼吸和乙烯釋放高峰比不耐貯的‘徐香’晚且峰值低。這與 Gwanpua 等（2013）報(bào)道的采收后快速軟化的品種乙烯釋放量相對較高，而軟化相對緩慢的品種相對較低的結(jié)果一致。
3.3 淀粉含量與果實(shí)耐貯性的關(guān)系
淀粉有維持細(xì)胞膨壓的作用，對細(xì)胞起支撐作用（張永平 等，2008；Yang et al.，2013）。隨著采收后呼吸速率和乙烯釋放量的增加，淀粉酶活性升高，促進(jìn)淀粉迅速水解，引起細(xì)胞膨壓降低，果實(shí)軟化。在本研究中，‘海沃德’的淀粉含量一直高于‘徐香’，淀粉酶活性也較低，這是在整個(gè)貯藏期間前者硬度始終高于后者的原因之一。同時(shí)，對兩品種組織結(jié)構(gòu)觀察也表明了‘海沃德’剛采收時(shí)，果肉細(xì)胞中含有較多淀粉顆粒，隨著貯藏時(shí)間延長，淀粉顆粒不斷減少，但減少幅度比‘徐香’小。
3.4 細(xì)胞壁多糖降解與果實(shí)耐貯性的關(guān)系
果肉細(xì)胞壁的完整性決定了果實(shí)硬度。果膠和纖維素是構(gòu)成果肉細(xì)胞壁的重要物質(zhì)，果膠是果實(shí)細(xì)胞壁中膠層的主要組分（Seymour et al.，1990）。果實(shí)硬度與果膠降解、果膠酶活性的變化密切相關(guān)（Ketsa & Daengkanit，1999；羅靜 等，2018）。本研究結(jié)果顯示，采收初期耐貯藏的獼猴桃‘海沃德’的原果膠和纖維素含量都比不耐貯藏的‘徐香’高，前者細(xì)胞壁厚度為后者的 2 倍；隨著果實(shí)的后熟，‘海沃德’的 PG、PE、β-Gal、Cx 活性高峰均比‘徐香’出現(xiàn)晚且峰值低，水溶性果膠的生成和原果膠、纖維素的分解比‘徐香’緩慢；在貯藏中期，‘徐香’中膠層基本溶解，微纖絲散落，細(xì)胞壁層變薄，果肉硬度迅速下降，而‘海沃德’中膠層仍可見，結(jié)構(gòu)較完整。
3.5 線粒體結(jié)構(gòu)與耐貯性的關(guān)系
線粒體代謝活性與果實(shí)的成熟軟化有著必然的聯(lián)系（闞娟 等，2015）。細(xì)胞衰老時(shí)線粒體功能會發(fā)生退行性改變，線粒體功能的正常有賴于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定（Kataoka et al.，2005；Collman et al.，2008）。本試驗(yàn)中，獼猴桃果實(shí)伴隨著硬度的下降線粒體結(jié)構(gòu)均有退化。但是至貯藏末期，不耐貯藏的‘徐香’線粒體膜裂解較為嚴(yán)重，均已空泡化，而耐貯藏的‘海沃德’結(jié)構(gòu)相對完整，這說明了相對完整的線粒體結(jié)構(gòu)可能是其維持較高硬度的原因之一。
Abstract：Two kiwifruit cultivars‘Xuxiang’（shorter storage life）and‘Hayward’（long storage life），were used to study the changes in physiological and tissue structure during storage at 0 ℃，so as to explore the internal mechanism of kiwifruit storage ability，and provide information for further selection of excellent cultivars with good storability. The results showed that the firmness of both kiwifruit cultivars decreased continuously，and the time of firmness dropping to 10 N during storage was 150 days and 95 days for‘Hayward’and‘Xuxiang’，respectively. The peaks of respiratory rate and ethylene release rate on‘Xuxiang’appeared 20 days and 10 days earlier than that of‘Hayward’，and the peak values were 16% and 250% higher than that of‘Hayward’，respectively. The higher weight loss rate was observed on‘Xuxiang’as compared with‘Hayward’. From the maturity stage to the following storage period，the contents of starch，protopectin and cellulose of‘Hayward’were higher than that of‘Xuxiang’，while the enzyme peak activities of amylase（AM），pectin（PG，PE，β-Gal）and cellulase（Cx）were lower than that of‘Xuxiang’. In terms of fruit tissue structure，the epidermal hair of‘Hayward’was significantly shorter than that of‘Xuxiang’. Moreover，the thickness of cuticle and the number of epidermal cells were larger than that of‘Xuxiang’. The degree of deformation in pulp cells of‘Hayward’during storage was less than that of‘Xuxiang’. Fruit ultrastructure showed that the cell wall of‘Hayward’was thicker than that of‘Xuxiang’；in addition，the division speed of cell wall and intercellular layer in‘Hayward’was slower as compared with‘Xuxiang’. Meanwhile，the mitochondria showed relative structural integrity in‘Hayward’. In conclusion，kiwifruit with good storage ability has thick cuticle and epidermal cells，low weight loss rate，slow respiration rate and ethylene release rate，and low cell wall enzyme activity.
Keywords：kiwifruit；storability；pectinase；ultrastructure；tissue structure
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