摘 要：通過體外試驗，研究傘形花內(nèi)酯對擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）生長的影響；同時以美味獼猴桃‘布魯諾’（Actinidia deliciosa‘Bruno’）為材料，研究 0.5 mg · mL-1 傘形花內(nèi)酯處理對獼猴桃果實品質(zhì)和腐爛率，以及果實損傷接種 P. expansum 后病斑直徑和抗病相關(guān)酶活性及其基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，傘形花內(nèi)酯能夠有效抑制 P. expansum 孢子萌發(fā)和菌落生長（體外）；延緩獼猴桃果實可滴定酸和維生素 C 下降，以及可溶性固形物含量上升，降低果實的腐爛率；降低貯藏后期果實損傷接種 P. expansum 后病斑直徑，延緩棒曲霉素的積累，提高果肉幾丁質(zhì)酶（CHT）、β–1,3–葡聚糖酶（GLU）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，以及編碼這些酶的基因相對表達(dá)量。結(jié)果表明傘形花內(nèi)酯處理有助于保持獼猴桃采后果實品質(zhì)，并誘導(dǎo)提高果實對青霉病的抗性。
關(guān)鍵詞：獼猴桃；果實；傘形花內(nèi)酯；品質(zhì)；擴(kuò)展青霉；抗病性
獼猴桃是典型的呼吸躍變型果實，采收后軟化快，由病原微生物侵染造成的腐爛是果實采后損失的主要原因（Chan & Tian，2005；Song et al.，2009）。擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）容易從果實傷口及其他病原菌侵染點侵入，過熟或長時貯藏的獼猴桃果實也易遭受 P. expansum 浸染，發(fā)生青霉?。⊿ommer et al.，1983；Hur et al.，2005）。P. expansum 不僅導(dǎo)致果實腐爛，而且產(chǎn)生真菌毒素——棒曲霉素而危及食品安全（Neri et al.，2010）。將 4 種 P. expansum 菌株接種至蘋果、梨、桃、杏、獼猴桃和草莓等果實中，發(fā)現(xiàn)這些菌株能夠引起所有果實青霉病害和棒曲霉素積累。Reddy 等（2010）研究發(fā)現(xiàn)接種 10 種 P. expansum 菌株，都導(dǎo)致了獼猴桃果實腐爛和棒曲霉素積累。因此，為了保障果品及其產(chǎn)品的品質(zhì)和食用安全，極有必要重視對青霉病及棒曲霉素控制的研究和檢測。傘形花內(nèi)酯又名 7–羥基香豆素，是一種香豆素類化合物，屬于多酚類物質(zhì)。體外試驗發(fā)現(xiàn)，傘形花內(nèi)酯對桃褐腐病菌、棉花紅腐病菌、草莓灰霉病菌、辣椒炭疽病菌的生長均有抑制作用，其最小抑制濃度（The minimum inhibition concentration，MIC）分別為 250、500、1 000 和 2 000 μg · mL-1（白雪娜 等，2012）。趙磊等（2012）發(fā)現(xiàn)，瑞香科狼毒屬植物中的瑞香狼毒活性物質(zhì)以傘形花內(nèi)酯為主要成分，能有效破壞草莓灰霉病菌孢子和菌絲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。同時，酚類化合物處理能有效控制蘋果采后果實 P. expansum 病害和棒曲霉素的積累（Sanzani et al.，2009）。王媛等（2015）發(fā)現(xiàn)多酚及植物精油對 P. expansum 生長和產(chǎn)毒有一定抑制作用。目前外源酚類物質(zhì)能否控制獼猴桃采后青霉病的控制尚未見報道。研究傘形花內(nèi)酯處理對獼猴桃果實品質(zhì)和腐爛的影響，特別是對果實刺傷接種 P. expansum 后抗病性的影響，以期為獼猴桃采后果實品質(zhì)和青霉病害控制提供理論依據(jù)。
▲夏天的獼猴桃果園
1 材料與方法
1.1 試驗材料與處理
美味獼猴桃‘布魯諾’果實于 2015 年 10 月 27 日采于浙江省溫州市泰順縣尚進(jìn)農(nóng)業(yè)合作社獼猴桃種植基地。在揚花期后 160 d 采摘大小成熟度基本相同，無病蟲害，無機(jī)械傷的果實，當(dāng)天運回杭州實驗室（大約 6 h）。
（陜西周至獼猴桃果園）
果實分別用清水（對照）和傘形花內(nèi)酯 0.5 mg · mL-1（經(jīng)預(yù)備試驗從 0、0.5、1.0、1.5 和 2.0 mg · mL-1中確定的處理濃度，傘形花內(nèi)酯購買于阿拉丁試劑公司，純度為 99%）溶液浸泡 10 min，自然風(fēng)干后分別放入已清洗消毒干凈的塑料筐中，筐外套上 0.05 mm 聚乙烯薄膜袋，不封口，置于（20 ± 1）℃恒溫箱中（型號：MIR-553），每個筐 15 個果實，對照和處理組各 24 筐。對照和處理組各固定 4 筐用于統(tǒng)計果實腐爛率，每筐作為 1 個重復(fù)；另取 4 筐用于取樣測定果實的可溶性固形物（SSC）、可滴定酸（TA）和維生素 C 的含量，每 3 d 取樣 1 次。
▲獼猴桃果園幼果
1.2 相關(guān)指標(biāo)測定
1.2.1 傘形花內(nèi)酯對 P. expansum 孢子萌發(fā)和菌落擴(kuò)展影響的測定參照朱玉燕等（2015）的方法制備 1.8 × 106 CFU · mL-1 的 P. expansum 孢子懸浮液待用。孢子萌發(fā)率測定：取9個150 mL錐形瓶，3個為1組分成3組，分別含0（對照）、0.5和1.0 mg · mL-1傘形花內(nèi)酯溶液的PDB培養(yǎng)基，每瓶100 mL。每瓶加入1 mL孢子懸浮液，在25 ℃條件下100 r · min-1振蕩培養(yǎng) 16 h，然后在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計其孢子萌發(fā)率。體外菌落擴(kuò)展測定：經(jīng)過 121 ℃滅菌的 PDA 培養(yǎng)基冷卻至 45 ~ 55 ℃后，倒入玻璃平皿，每皿20 mL。待冷卻凝固后分別加入 200 μL 清水（對照）、0.5 和 1.0 mg · mL-1 傘形花內(nèi)酯溶液，涂布均勻，在平板中央放入直徑 1 cm 的圓形濾紙片，并在上面加入 200 μL 的孢子懸浮液，在 28 ℃條件下培養(yǎng)。于培養(yǎng) 3、5、7 d 時用十字交叉法測定菌餅直徑，每組 5 個平板作為 5 次重復(fù)。
▲Golden Kiwi
1.2.2 果實品質(zhì)指標(biāo)的測定
固定 4 筐，每 3 d 從每筐取 3 個（共 12 個果實），去皮，取不含種子的中部果肉，切碎混勻。采用 Way-2S 數(shù)顯阿貝折射儀（上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司）測定果肉的可溶性固形物（SSC），酸堿滴定法測定可滴定酸（TA）含量，2,6–二氯酚靛酚滴定法測定維生素 C 含量。每個指標(biāo) 3 次重復(fù)。
1.2.3 果實自然腐爛率的觀測
對照和處理組各固定 4 筐，每 3 d 觀察 1 次發(fā)病情況，果實可見腐爛病斑作為腐爛果實，腐爛果實的百分率為果實自然腐爛率。
1.2.4 果實刺傷接種后病斑直徑的測定
對照和處理組各 16 筐，果實放置 48 h 后，參照朱玉燕等（2015）的方法用滅菌的鐵釘在果實赤道部位刺一個 3 mm × 3 mm 的傷口，接種 15 μL 1.8 × 106 CFU · mL-1 的 P. expansum 孢子懸浮液，繼續(xù)貯藏（20 ± 1）℃，然后每 2 d 測定 1 次刺傷接種果實的病斑直徑和果肉抗病相關(guān)酶活性的變化。
▲播宏獼猴桃花粉
1.2.5 果肉中棒曲霉素的測定
分別取 5.0 g 腐爛果肉和距離病斑周圍 5 ~ 15 mm 處的未腐爛果肉，參考 Sanzani 等（2009）和朱玉燕等（2015）的方法測定腐爛果肉和未腐爛果肉的棒曲霉素含量。
1.2.6 果實刺傷接種后抗病相關(guān)酶活性的測定
分別從 15 個果中收集腐爛果肉和病斑外未腐爛果肉（厚度約 2 cm），切碎并混勻，樣品經(jīng)液氮冷卻后于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?br />
CHT 的測定：取 4 g 未腐爛果肉，在 10 mL 0.1 mol · L-1 乙酸—乙酸鈉提取緩沖溶液（含 4%的PVP，1 mmol · L-1 的聚乙二醇 6000，1 mmol · L-1 的 EDTA，0.05%的 Triton X-100 和 5 mmol · L-1 的β–巰基乙醇，pH 5.2）中冰浴研磨成勻漿，然后在 4 ℃，10 000 × g 條件下離心 20 min，取上清液置于冰浴中，用于酶活性的測定（Boller，1983），以單位時間單位果肉樣品中的酶分解膠狀幾丁質(zhì)生成 1 μmol N–乙酰葡萄糖胺作為 1 個酶活性單位。
GLU 的測定：取 1 g 未腐爛果肉，在 5 mL 檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH 5.0）中冰浴研磨成勻漿，4 ℃，8 000 × g 條件下離心 30 min，取上清液置于冰浴中，用于酶活性的測定（Abeles & Forrence，1970），以單位時間單位果肉樣品中的酶分解昆布多糖生成 1 μmol 葡萄糖作為 1 個酶活性單位。
PAL 的測定：取 2 g 未腐爛果肉，在 5 mL 0.1 mol · L-1 硼酸—硼砂提取緩沖溶液（含 40 g · L-1的 PVP，2 mmol · L-1 的 EDTA 和 5 mmol · L-1 的 β–巰基乙醇，pH 8.8）中冰浴研磨成勻漿，4 ℃，12 000 × g 條件下離心 30 min，取上清液置于冰浴中，用于酶活性的測定（曹建康 等，2007），以單位時間、單位果肉組織酶促反應(yīng)體系吸光度值增加 0.01 為 1 個 PAL 活性單位。
▲正在采摘獼猴桃雄花
1.2.7 果實損傷接種后抗病相關(guān)酶基因表達(dá)的測定
RNA 提取：取 2 g 未腐爛果肉，參考 Zhu 等（2013）的方法進(jìn)行獼猴桃果肉總 RNA 提取。逆轉(zhuǎn)錄試驗：用 SuperScript? III First-Strand Synthesis Super Mix 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄試驗。Real-time PCR 檢測：用多重實時熒光定量 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，引物及條件如表 1，擴(kuò)增總體系為
20 μL，包括 8 μL SDW，10 μL Power SYBR? Green Master Mix，0.5 μL Forward Primer（10 μmol · L-1），0.5 μL Reverse Primer（10 μmol · L-1）和 1 μL cDNA；反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；40 個循環(huán)（95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s，收集熒光）；55 ~ 95 ℃熔點曲線。
▲yellow Kiwifruit
2 結(jié)果與分析
2.1 傘形花內(nèi)酯對 P. expansum 孢子萌發(fā)和菌落擴(kuò)展的影響傘形花內(nèi)酯處理能夠有效抑制 P. expansum 的孢子萌發(fā)率，0.5 和 1.0 mg · mL-1 濃度處理的孢子萌發(fā)率分別為對照（0 mg · mL-1）的 30.82%和 20.24%（圖 1，A）。P. expansum 菌落直徑隨培養(yǎng)時間的延長而不斷擴(kuò)大，但 0.5 和 1.0 mg · mL-1 濃度處理顯著抑制了菌落直徑的擴(kuò)大（圖 1，B）。
2.2 傘形花內(nèi)酯處理對果實可溶性固形物、可滴定酸和維生素 C 含量的影響果肉可溶性固形物含量在采后 1 ~ 7 d 不斷增加，之后對照果實的基本保持不變。在 4 ~ 10 d 貯藏期間，傘形花內(nèi)酯處理的果實可溶性固形物含量顯著低于對照（圖 2，A）。 可滴定酸含量總體上呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，傘形花內(nèi)酯處理果實在采后 4 ~ 10 d 顯著高于對照（圖 2，B）。傘形花內(nèi)酯處理果實的維生素 C 含量在采后 4 ~ 10 d 顯著高于對照（圖 2，C）。
▲Health Benefits of Kiwi Fruit
2.3 傘形花內(nèi)酯處理對果實腐爛率、損傷接種后病斑直徑的影響
對照和處理果實分別在采后 7 d 和 10 d 開始發(fā)生腐爛，而后腐爛率不斷增加，但傘形花內(nèi)酯處理果實的腐爛率顯著低于對照（圖 3，A）。果實接種 P. expansum 后 3 d 病斑直徑開始擴(kuò)大，傘形花內(nèi)酯處理的果實病斑直徑在接種后 5 ~ 9 d顯著小于對照（圖 3，B）。
2.4 傘形花內(nèi)酯處理對果肉中棒曲霉素含量積累的影響
分別于果實損傷接種 P. expansum 后 3 d 和 5 d 檢測到棒曲霉素，腐爛果肉的棒曲霉素含量是未腐爛果肉的近百倍（圖 4）。在腐爛果肉中，傘形花內(nèi)酯處理在貯藏期間不斷增加，而對照的棒曲霉素含量急劇增加在接種后 5 d 達(dá)到峰值，之后降低又增加；腐爛果肉中的棒曲霉素含量接種后 3 ~ 5 d 顯著低于對照，9 d 顯著高于對照（圖 4，A）。在未腐爛果肉中，棒曲霉素含量隨著貯藏時間的增加總體上呈上升趨勢，但處理果實在接種后 5 d 和 9 d 顯著低于對照；其中，9 d 時處理果實的棒曲霉素含量為 0.20 μg · g-1，比對照果肉減少了 36.49%（圖 4，B）。
▲遵義市播宏獼猴桃果園有限公司是獼猴桃花粉生產(chǎn)廠家
2.5 傘形花內(nèi)酯處理對損傷接種 P. expansum 后果肉抗病相關(guān)酶活性的影響
對照和處理組果實的 CHT 活性急劇增加并在接種后 3 d 到達(dá)峰值，而后不斷降低；處理果實在接種后 3 ~ 9 d 顯著高于對照（圖 5）。
對照和處理組果實的 GLU 活性急劇增加并在接種后 7 d 到達(dá)峰值，而后降低；處理果實在接種后 3 ~ 7 d 顯著高于對照（圖 5）。
對照和處理組果實的 PAL 活性大致呈增加趨勢；且處理果實在貯藏期間顯著高于對照（圖 5）。2.6 傘形花內(nèi)酯處理對損傷接種 P. expansum 后果肉抗病相關(guān)酶基因表達(dá)的影響隨著貯藏時間的延長，CHT、GLU 和 PAL 基因相對表達(dá)量急劇增加，但傘形花內(nèi)酯處理分別在接種后 5 ~ 9 d、5 ~ 7 d 和 3 ~ 9 d 顯著高于對照（圖 5）。
▲Kiwi Orchard Work
3 討論
可溶性固形物、可滴定酸含量是衡量果實最常規(guī)的營養(yǎng)指標(biāo)，維生素 C 含量是衡量獼猴桃果實品質(zhì)的最重要指標(biāo)。在常溫貯藏下，傘形花內(nèi)酯處理有效抑制了獼猴桃果實可溶性固形物增加和可滴定酸降低，并有助于保持維生素 C。表明傘形花內(nèi)酯處理有助于保持獼猴桃果實采后的營養(yǎng)品質(zhì)。酚類物質(zhì)作為植物中常見的次級代謝產(chǎn)物，具有抗氧化作用，而且對很多病原菌都有抗菌性（Mahmoudi et al.，2016）。本試驗結(jié)果表明 0.5 和 1.0 mg · mL-1 傘形花內(nèi)酯有效抑制了 P. expansum孢子萌發(fā)和菌落擴(kuò)展；同時，0.5 mg · mL-1 傘形花內(nèi)酯處理顯著降低了獼猴桃果實的腐爛率，抑制了損傷接種 P. expansum 后病情的發(fā)展。表明傘形花內(nèi)酯能夠有效抑制 P. expansum 等病原菌的生長，從而降低果實采后腐爛率，這與 Sanzani 等（2009）在蘋果上的研究結(jié)果一致。
▲獼猴桃雄花展示
棒曲霉素作為一種有毒的真菌次級代謝產(chǎn)物，主要由青霉菌屬（Penicillium）、絲衣霉屬 （Byssochlamys）、曲霉屬（Aspergillus）等多種真菌產(chǎn)生（Ciegler，1978）。腐爛果肉的棒曲霉素含量變化與其生物合成、降解和擴(kuò)散，以及病斑擴(kuò)展相關(guān)。本試驗中發(fā)現(xiàn)獼猴桃果實接種 P. expansum3 d 后，果實病斑擴(kuò)展和腐爛果肉中棒曲霉素含量急劇增加，而 5 d 后病斑不斷擴(kuò)展，但棒曲霉素含量變化與病情發(fā)展并不同步，說明 P. expansum 侵染果實后其產(chǎn)毒能力可能在前階段較強(qiáng)，7 d 時棒曲霉素含量降低可能是病斑擴(kuò)展速率高于 P. expansum 的產(chǎn)毒速率而引起的稀釋效應(yīng)，9 d 時又增加可能是棒曲霉素的累積效應(yīng)。研究表明：棒曲霉素可從蘋果腐爛果肉中向未腐爛果肉中擴(kuò)散并積累（Bandoh et al.，2009），而果實中維生素 C 和硫醇類等化合物對棒曲霉素具有一定的降解消除作用（Neri et al.，2010）。本試驗中發(fā)現(xiàn)：獼猴桃未腐爛果肉在接種 P. expansum 5 d 時檢測到了棒曲霉素，但其含量水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于腐爛果肉中的含量。表明棒曲霉素同樣可從獼猴桃腐爛果肉向未腐果肉擴(kuò)散，但在未腐爛果肉中累積的效應(yīng)不明顯，是因為棒曲霉素向獼猴桃未腐爛果肉擴(kuò)散效率低，還是果肉維生素 C 對棒曲霉素的降解，這還需進(jìn)一步研究。另外，接種 P. expansum 后，傘形花內(nèi)酯處理果實腐爛果肉的棒曲霉素含量在 5 d 時顯著低于對照，在 9 d 時卻顯著高于對照，說明傘形花內(nèi)酯處理可抑制 P. expansum 侵染后前期的產(chǎn)毒能力，緩解棒曲霉素在果肉中累積的速率。
（紅心獼猴桃花粉制作過程）
植物受到病原菌侵染時產(chǎn)生一些病程相關(guān)蛋白來抵御其進(jìn)一步的侵染，其中 CHT 和 GLU 是兩類重要的病程相關(guān)蛋白，在抗病過程中發(fā)揮重要的作用。因為 CHT 能夠降解大多數(shù)病原菌的細(xì)胞壁，具有直接的抑菌作用（Ji & Kuc，1996；Mauch et al.，1988）；GLU 能夠降解病原菌菌絲細(xì)胞壁上的β–1,3–葡聚糖，間接起到抗病作用（Ward et al.，1991）。PAL 是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，對植物抵抗病原菌的侵害有著重要的作用（Wilson，1998）。與對照相比，傘形花內(nèi)酯處理顯著提高了美味獼猴桃‘布魯諾’果實損傷接種 P. expansum 后果肉 CHT、GLU 和 PAL 等抗病相關(guān)酶活性及其基因相對表達(dá)量。說明傘形花內(nèi)酯能夠誘導(dǎo)提高美味獼猴桃果實對 P. expansum 的抗性，進(jìn)而抑制果實病情的發(fā)展。
為了明確傘形花內(nèi)酯處理在獼猴桃果實貯藏保鮮中的應(yīng)用，有關(guān)傘形花內(nèi)酯處理對獼猴桃果實采后主要病害的抑制效應(yīng)，以及對紅陽、金艷及金魁等獼猴桃品種果實采后品質(zhì)和病害的作用效應(yīng)尚需進(jìn)一步研究。
▲新西蘭的獼猴桃雄花園Kiwi Male Garden in New Zealand
Abstract：The effects of umbelliferone on controlling Penicillium expansum growth（in vitro）and on regulating the quality and disease resistance to P. expansum in kiwifruit（Actinidia deliciosa‘Bruno’）were investigated. The results showed that，as compared with control，the spore germination and colony diameter of P. expansum were significantly reduced on potato dextrose broth（PDB）or potato dextrose agar （PDA）containing 0.5 or 1.0 mg · mL-1 umbelliferone. Moreover，0.5 mg · mL-1 umbelliferone treatment slowed the decreases in titratable acid（TA）and vitamin C content，and the increase in soluble solid content
（SSC），and reduced the natural decay incidence of kiwifruit during storage. Also，0.5 mg · mL-1
umbelliferone treatment significantly inhibited the progress of rot and patulin accumulation caused by P.expansum，and induced increases in the activities of chitinase（CHT），β-1,3-glucanase（GLU），phenylalanine ammonialyase（PAL），and up-regulated the expression of these defense-related enzymes in kiwifruit after inoculation of P. expansum suspension. Thus，it was suggested that the umbelliferone treatment could benefit the fruit quality and improved the disease resistance in kiwifruit against P. expansum during postharvest.
Keywords：kiwifruit；fruit；umbelliferone；quality；Penicillium expansum；disease resistance
▲獼猴桃花粉電子顯微鏡下照片
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