獼猴桃花粉貯藏方法比較D
作者：陳馨月，茍曉蝶，單真交，王 蓉，彭言劼，潘自輝，陳小溪
(1.樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院樂山614000;2.峨眉山生物多樣性保護(hù)與利用研究所樂山614000;3.大渡河流域特色水果博士工作站樂山614904;4.湖北省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院武漢 430079;5.襄陽市林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣站襄陽441022)
▲低溫儲(chǔ)藏花粉，使用前分裝獼猴桃花粉
摘 要: 為了提高獼猴桃花粉的貯藏水平，保障其貯藏后的生活力，以獼猴桃雄株品種‘海沃德’的花粉為試材，采用了花粉萌發(fā)測(cè)定法，比較分析獼猴桃花粉生活力在不同干燥方式及貯藏條件下的差異。結(jié)果表明：陰干干燥法所制備的獼猴桃花粉生活力最高，達(dá)到了45.85%，烘干干燥法所制備的獼猴桃花粉生活力最低，只有19.45%。
▲獼猴桃雌花、獼猴桃雄花
-20℃低溫貯藏條件能大大延長(zhǎng)獼猴桃花粉的生活力，貯藏11月后花粉活力仍能保持在16.58%。貯藏環(huán)境有無光照、是否放置硅膠對(duì)獼猴桃花粉生活力均無顯著性影響。該研究結(jié)果對(duì)于獼猴桃花粉貯藏技術(shù)的選擇具有重要參考意義。
關(guān)鍵詞：獼猴桃，花粉生活力，干燥方式，貯藏方法
▲獼猴桃花粉活性檢測(cè)
Comparison of Different Strategies for Pollen Storage of Actinidia chinensis
Chen Xinyue(”)Gou Xiaodie"Dan Zhenjiao(1)Wang Rong(”)Peng Yanjie(1.2,3) Pan Zihui4)Chen Xiaoxi (5)
(1. College of Life Sciences,Leshan Normal University Leshan 614000;
2. Institution of Biodiversity Conservation and Utilization in Emei Mountain Leshan 614000;
3. Doctor Research Center of Local Fruits on Dadu River ValleyLeshan 614904;
4.Hubei Provincial Forestry Investigation and Planning Institute Wuhan 430079;
5. Xiangyang Forestry Science and Technology Extending StationXiangyang441022)
Abstract:To improve storage quality of Actinidia chinensis pollen and to guarantee its viability after storage, pollen from male varieties ‘Hayward’of A. chinensis was used as test material for comparative analysis of the differences in the viability under various drying methods and storage conditions via the pollen germination assay. The results showed that findings demonstrated that dryness in the shade produced the most viable A. chinensis pollen,reached 45. 85% , while the ovendrying method produced the least viable pollen (19.45%). The A. chinensis pollen's vitality was considerably prolonged by the low-temperature storage settings at -20℃ and stayed at 16.58% after ll months of storage. The vitality of A. chinensis pollen was unaffected significantly by the storage environment with or without light and silica gel. The results of this study have important reference implications for the selection of pollen storage techniques for A. chinensis.
Key words: Actinidia chinensis ;pollen viability; drying methods;storage methods
▲獼猴桃花粉放入冰箱低溫保存
獼猴桃Actinidia chinensis屬獼猴桃科獼猴桃屬植物，分布在中國(guó)、日本、朝鮮以及歐亞大陸的溫帶地區(qū)，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。獼猴桃果實(shí)可食用，由于其清香鮮美，經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療效果好而廣受關(guān)注。獼猴桃為雌雄異株植物，雌株為果實(shí)型，雄株為傳粉型。在自然條件下，獼猴桃以昆蟲和風(fēng)媒授粉為主，但開花時(shí)間短、雌雄比例不當(dāng)、惡劣天氣等因素容易導(dǎo)致獼猴桃雌株出現(xiàn)授粉、受精不良的情況，而正常的授粉、受精是獼猴桃雌株正常結(jié)實(shí)的先決條件，也是其優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的基礎(chǔ)。為解決獼猴桃在雌花和雄花之間花期不遇和傳粉率低的難題，在生產(chǎn)中常采用人工授粉技術(shù)，以達(dá)到授粉的目的。在同一個(gè)果園中，同一品種的獼猴桃雄花通常要比雌花提前2~3d開花，而獼猴桃的花期又非常短暫，最短的只有3~5d，如果錯(cuò)失了傳粉的時(shí)機(jī)會(huì)影響一整年的收獲。因此，提前采集獼猴桃的花粉，并進(jìn)行人工輔助傳粉是最常用的方法。
▲獼猴桃花粉運(yùn)輸過程中需要低溫加冰袋
花粉的活性受干燥方式和貯藏條件的影響較大，在常溫下，儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)花粉的生活力有著很大影響，花粉生活力會(huì)隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加而急劇降低。但是，如果干燥方式及儲(chǔ)藏條件適宜，則可以顯著延長(zhǎng)花粉的生命。如何保存獼猴桃花粉能夠使獼猴桃花粉長(zhǎng)期保持活力成為亟待解決的問題。‘海沃德’是四川地區(qū)主要栽培獼猴桃雄株品種，本試驗(yàn)采用‘海沃德’獼猴桃雄株作為試材，通過比較不同干燥方式以及貯藏條件，研究花粉生活力的變化，以獲得最佳的干燥和貯藏效果，進(jìn)而為生產(chǎn)實(shí)踐中花粉貯藏提供依據(jù)，提高授粉效果。
▲獼猴桃花粉使用之前建議放到潮濕環(huán)境醒粉
1 材料與方法
1.1試驗(yàn)地概況
試驗(yàn)地點(diǎn)位于四川省樂山市樂山師范學(xué)院峨眉山生物多樣性保護(hù)與利用研究所，東經(jīng)103°45'，北緯 29°33'，海拔376.9m，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，常年平均溫度 13~21℃。
1.2 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)主要材料為‘海沃德’獼猴桃雄株花粉。獼猴桃花朵于2021年5月17日采集于5a生海沃德雄株，采集地點(diǎn)位于都江堰虹口鄉(xiāng)，屬中亞熱帶濕潤(rùn)氣候區(qū)，常年氣溫在14~21℃之間。獼猴桃園土壤類型為山地黃壤，pH值6.2。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 花粉的干燥方法
將花藥分為4份，分別通過陰干干燥法、搖床干燥法、烘干干燥法、真空干燥法進(jìn)行干燥處理(表1)。經(jīng)過干燥后，將潔凈的玻璃瓶壓在花藥上，用手輕輕按壓，讓花藥中的花粉被釋放出來。接著，將釋放出的花粉置于光滑紙面，用手指輕輕敲擊紙面，將花粉與花藥碎片等雜質(zhì)完全分離開來。收集不同干燥處理下的獼猴桃花粉，裝入對(duì)應(yīng)離心管中，并及時(shí)進(jìn)行花粉生活力測(cè)定，比較不同干燥方式對(duì)獼猴桃花粉生活力的影響。
▲獼猴桃花粉貯藏方法比較
1.3.2 花粉的貯藏條件及貯藏時(shí)間
將經(jīng)過不同干燥方法處理的獼猴桃花粉分別放置于200uL PCR 管中，并用封口膜封口，以保證密封貯藏環(huán)境，將其分別以6種不同貯藏方法儲(chǔ)藏(表 2)。每隔30d隨機(jī)選取PCR管，對(duì)獼猴桃花粉生活力進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，共貯藏11個(gè)月，探究獼猴桃花粉的貯藏條件及貯藏時(shí)間對(duì)其生活力的影響。
▲獼猴桃花粉貯藏方法比較
1.3.3 花粉生活力測(cè)定方法
花粉生活力測(cè)定采用花粉萌發(fā)測(cè)定法，配制配方為10%蔗糖+0.01%硼酸+0.001%硝酸鈣的培養(yǎng)液，用于花粉萌發(fā)培養(yǎng)。將不同處理下的裝有花粉的PCR管(花粉占 PCR管體積的 1/20)在室溫下放置30min后開蓋，以達(dá)到自然解凍的效果?；ǚ蹚?fù)蘇后，將培養(yǎng)液于26℃的恒溫金屬浴中加熱10min，使用移液槍吸取200μL培養(yǎng)液至裝有花粉的PCR管中，再使用小型離心機(jī)使每管的花粉沉底。以剪口槍頭吸取底部花粉混合液至提前標(biāo)記好的2mL離心管中，再吸取80uL培養(yǎng)液至裝有混合液的2mL離心管中，將花粉及培養(yǎng)液吹打混勻。將裝有混合液的2mL離心管放入26 ℃、200 rpm的搖床中培養(yǎng)6h。吹打混勻后吸取50μL混合液至潔凈載玻片上，用蓋玻片蓋好后置于光學(xué)顯微鏡10倍目鏡、40倍物鏡下觀察花粉的萌發(fā)情況。每個(gè)處理隨機(jī)選擇5管花粉，每管隨機(jī)選取1個(gè)至少有10?；ǚ鄣囊曇斑M(jìn)行觀察，以花粉管長(zhǎng)度超過花粉粒直徑1/2的花粉為萌發(fā)花粉，對(duì)視野中的花粉萌發(fā)數(shù)及花粉總數(shù)進(jìn)行記錄，最終對(duì)5個(gè)視野花粉萌發(fā)率進(jìn)行計(jì)算，取其平均值作為該處理的萌發(fā)率。
花粉生活力(%)=視野中萌發(fā)花粉數(shù)/視野中花粉總數(shù)X100%。
▲優(yōu)質(zhì)的獼猴桃花蕾
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用Excel2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS25進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用 Origin 2022、GraphPad Prism9作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同干燥方式對(duì)獼猴桃花粉生活力的影響
試驗(yàn)結(jié)果表明，不同干燥方式對(duì)獼猴桃花粉生活力有著不同的影響(ANOVA,p<0.01)。陰干干燥法所得的花粉生活力顯著高于搖床干燥法、烘干干燥法、真空干燥法所得的花粉生活力(表3)，其余干燥方式所得花粉生活力之間并無顯著差異，但烘干干燥法的花粉生活力最低。
▲獼猴桃花粉貯藏方法比較
2.2 不同貯藏溫度和時(shí)間對(duì)獼猴桃花粉生活力的影響
根據(jù)干燥效果，將陰干干燥的獼猴桃花粉用于探究不同儲(chǔ)存條件及儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)獼猴桃花粉生活力影響的材料。在陰干干燥條件下，貯藏溫度對(duì)花粉生活力有顯著性影響(ANOVA,p<0.01)。貯藏11月后，花粉生活力在-20℃條件下保存效果最好(16.58%)，其次為-80℃(12.68%)，4℃及常溫條件下獼猴桃花粉萌發(fā)率均為0。常溫條件下貯藏的花粉生活力下降迅速，于第4個(gè)月全部失去活力；與常溫條件下貯藏相比，4℃條件下貯藏的花粉生活力失去活力速度總體相對(duì)較緩，0~1個(gè)月下降迅速，下降了 27.24%，第5個(gè)月時(shí)花粉生活力為3.06%，5個(gè)月后花粉材料丟失，但因花粉活力很低，不影響后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果；-20℃條件下貯藏的獼猴桃花粉生活力在0~7個(gè)月間變化緩慢，7個(gè)月后下降迅速，7~8個(gè)月時(shí)下降了29.10%，此后保持在一定范圍內(nèi)變化，第11個(gè)月時(shí)花粉生活力為16.58%；-80℃條件下貯藏的獼猴桃花粉生活力在0~3個(gè)月時(shí)下降較緩，第3~6月下降速度較快，下降了18.56%，在10個(gè)月時(shí)花粉生活力仍能保持在30.47%，第10個(gè)月后下降迅速，10~11個(gè)月下降了17.79%。此外，貯藏時(shí)間對(duì)獼猴桃花粉生活力也存在顯著性影響(ANOVA,p<0.01)。獼猴桃花粉生活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低(圖 1)。
▲獼猴桃花粉貯藏方法比較
2.3 干燥方式及貯藏溫度對(duì)獼猴桃花粉生活力的綜合影響
不同干燥方式在不同保存溫度的條件下保存11個(gè)月后，花粉生活力有所差異(圖2)。花粉生活力強(qiáng)弱表現(xiàn)為-20℃陰干(16.58%)最優(yōu)，其次依次為-80℃陰干(12.68%)、-80℃真空(1.71%)、-20℃搖床(1.05%)、-20℃真空(0.91%)，其余均為0。干燥方式為陰干時(shí)，-20℃貯藏下的花粉生活力(LSD,p<0.05)顯著高于常溫、4℃、-80℃，-80℃貯藏下的花粉生活力(LSD,p<0.05)也顯著高于常溫、4℃。其余干燥方式下各溫度之間花粉生活力無顯著差異。
2.4 光照對(duì)獼猴桃花粉貯藏的影響 在干燥方式為陰干、貯藏溫度為4℃的條件下，光照的有無對(duì)獼猴桃花粉生活力無顯著性影響(ANOVA,p>0.05)。二者均在貯藏1月時(shí)花粉生活力下降迅速，避光條件下下降了27.24%，光照條件下下降了25.77%，之后下降緩慢，活力保持在較低水平。第5個(gè)月時(shí)，避光條件下獼猴桃花粉生活力降至3.06%，光照條件下獼猴桃花粉生活力降至5.08%(圖 3)。
2.5 硅膠對(duì)獼猴桃花粉貯藏的影響
在干燥方式為陰干、貯藏溫度為-20℃的條件下，硅膠的有無對(duì)獼猴桃花粉生活力無顯著性影響(ANOVA,p>0.05)。在無硅膠的貯藏條件下，獼猴桃花粉生活力在0~7個(gè)月變化較緩，7~8個(gè)月下降迅速，下降了29.10%；8~11個(gè)月變化較緩，花粉生活力在一定范圍內(nèi)波動(dòng)；11個(gè)月時(shí)花粉生活力保持在16.58%。在-20℃陰干有硅膠的貯藏條件下，獼猴桃花粉生活力在0~5個(gè)月變化緩慢，5~6個(gè)月花粉生活力下降較為迅速，下降了17.46%，之后花粉生活力在一定范圍內(nèi)變化，11 個(gè)月時(shí)花粉生活力仍能保持在20.65%(圖4)。
▲獼猴桃花粉貯藏方法比較
3 討論
獼猴桃的花期很短，而且花粉的活性很大程度上受溫度及濕度的影響。在開花期間，如果遇到了寒冷或者是多雨的天氣，會(huì)對(duì)花粉的正常生長(zhǎng)和傳播產(chǎn)生不利的影響，并且獼猴桃園中的獼猴桃雌雄株可能不是同一品種，花期很可能不遇，這些情況都容易導(dǎo)致獼猴桃錯(cuò)失最佳的傳粉期，從而對(duì)坐果率和產(chǎn)量產(chǎn)生不利的影響。進(jìn)行花粉貯藏以及人工輔助授粉可有效提高授粉成效，花粉干燥方式和貯藏條件對(duì)花粉生活力的保持有著重要影響，因此，選擇適宜的干燥方式及貯藏條件貯藏花粉顯得尤為重要。
花粉采集后的干燥方式對(duì)花粉生活力的影響至關(guān)重要，它會(huì)直接影響花粉的活性，因此在花粉處理過程中，應(yīng)該選擇合適的干燥方式，以保證其活力。姚春潮等認(rèn)為，干燥速度越快，花粉生活力越高，恒溫干燥條件下，所得花粉生活力優(yōu)于陰干干燥。楊紅等認(rèn)為，經(jīng)陰干干燥法干燥的花粉活性，因區(qū)域及環(huán)境的不同而有差異。本研究采用的方法中，陰干干燥后獼猴桃花粉生活力最高，真空干燥優(yōu)于搖床干燥，而烘干干燥最差。已有研究中最長(zhǎng)烘干時(shí)間為8h，而本試驗(yàn)烘干干燥了12h，可能是由于干燥時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致花粉失活嚴(yán)重。
▲獼猴桃花粉儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過程需要低溫
收集花粉后如何貯藏是關(guān)于獼猴桃研究的熱點(diǎn)問題，也是本試驗(yàn)重點(diǎn)研究的問題。已有研究表明，貯存溫度對(duì)花粉的活性有很大的影響，在低溫下，花粉的保存效果會(huì)更好，花粉生活力會(huì)更高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，獼猴桃花粉采集并干燥后，四種貯藏溫度中，常溫貯藏的獼猴桃花粉失去活力最為迅速，在需長(zhǎng)期保存時(shí)不予采用。4℃可用于短期貯藏，貯藏時(shí)間最好在一個(gè)月之內(nèi)。資料顯示，如果要長(zhǎng)期貯藏，在超低溫貯藏的條件下能保持最高花粉生活力，但本研究中，采用-80℃貯藏的效果不如-20℃，可能是由于超低溫貯藏需要較好的解凍技術(shù)，而解凍過程的質(zhì)量正是影響花粉生活力的重要原因之一。在后續(xù)研究中，可對(duì)解凍技術(shù)進(jìn)行深入探究，以判斷是否為解凍影響了本研究中的花粉生活力。
▲testing pollen
除貯藏溫度，本研究還對(duì)貯藏時(shí)光照和硅膠對(duì)花粉生活力的影響進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，光照的有無對(duì)獼猴桃花粉生活力沒有顯著性影響，此結(jié)論與張洪偉等一致。因此，貯藏獼猴桃花粉時(shí)無須刻意遮光。張全鋒等認(rèn)為，花粉放置于干燥環(huán)境中，活力下降速度變慢。本試驗(yàn)研究結(jié)果得出，硅膠的有無對(duì)獼猴桃花粉生活力沒有顯著性影響，可能是由于本試驗(yàn)各處理均為密封貯藏，導(dǎo)致有無硅膠對(duì)獼猴桃花粉貯藏影響不大。在后續(xù)研究中，可進(jìn)一步探究在非密閉環(huán)境下，硅膠對(duì)獼猴桃花粉活力的影響。
▲獼猴桃花粉打包好即將發(fā)運(yùn)
4 結(jié)論
在樂山地區(qū)進(jìn)行獼猴桃花粉貯藏時(shí)，采集花粉后宜選擇陰干干燥法進(jìn)行干燥，以保持較高的花粉生活力。獼猴桃花粉最適合的貯藏條件為低溫保存，貯藏溫度為-20℃和-80℃時(shí)，能保證較高的花粉生活力，但-80℃需要適合的解凍和復(fù)蘇技術(shù)，相比之下，-20℃在保障貯藏效果的情況下更加簡(jiǎn)便易行。本研究的結(jié)果也能為其他地區(qū)的獼猴桃花粉貯藏提供依據(jù)，可在獼猴桃花粉貯藏中推廣應(yīng)用。
▲獼猴桃花粉冷藏保存運(yùn)輸Kiwi pollen refrigerated storage and transportation，播宏果業(yè)是貴州省最大的獼猴桃種植公司，種植1200畝高山獼猴桃，其中獼猴桃花粉項(xiàng)目是中國(guó)單體面積最大的獼猴桃花粉園，豐產(chǎn)期產(chǎn)花粉400公斤，提供高品質(zhì)、高倍體、高活性的獼猴桃花粉。聯(lián)系微信18030405084
評(píng)論